Преимплантацијска дијагностика (ПГД) дијагноза насљедних болести и ембриона / Репродуктологија

Генетичко тестирање је метода која се користи за дијагностицирање насљедних дефеката у ембрионима који се добијају ин витро оплодњом прије трудноће. Дијагноза пре имплантације (ПГД) је алтернатива амниоцентези и биопсији хорионских вила, што је често праћено тешком одлуком о прекиду трудноће ако су резултати неповољни.. Данас је ПГД једина могућа опција да се избјегне висок ризик од појаве дјетета с генетским болестима..

У којим случајевима се ПГД изводи у случају генетских патологија

Индикације за предимплантацијску дијагнозу генетиком:
Носилац аутосомно рецесивних болести;
Патологија повезана са Кс хромозомом;
Парови са значајним транслокацијама хромозома који ометају имплантацију, изазивају побачаје, или подразумевају менталне или физичке проблеме у потомству;
Носилац аутосомно доминантних болести.

Дијагноза пре имплантације се користи за патологију повезану са сполом, дефекте једног гена и хромозомске поремећаје..

Злоупотребе везане за секс

Болест која је повезана са Кс преносе се детету преко мајке која је носилац. Патолошки Кс хромозом узрокује болест код синова који не наслеђују нормалан Кс хромозом од свог оца, али добијају И хромозом. У будућности се очекује рађање здравих дечака, али је вероватноћа превоза кћери 50%, под условом да је мајка здравља.

Важно је

Болести повезане са Кс хромозомом никада се не преносе од оца до сина.

Аутосомна рецесивна патологија укључује хемофилију, већину неуромускуларних дистрофија и стотине других болести..

Аутосомни доминантни поремећаји манифестоваће се Реттовим синдромом, псеудо-хиперпаратироидизмом, рахитисом отпорним на витамин Д, Блоцх-Сулзбергера синдромом (насљедни поремећај пигментације коже са патологијом видног апарата, зуба и централног нервног система), итд..

И хромозом носи незнатан број гена, али неке патологије сексуалне диференцијације су повезане са њом..

У тешким облицима поремећене сперматогенезе (критично мали број или потпуно одсуство мушких заметних ћелија) у 18% случајева микроделеције се дијагностикују у гену фактора азооспермије који се налази на дугом краку У хромозома.

Појединачни дефекти гена

ПГД се користи за идентификацију појединачних дефеката гена који узрокују бројне болести:

Цистична фиброза;
Тхаи Сацхс болест;
Анемија српастих ћелија;
Хунтингтонова болест.

Уз ове патологије, генетска дијагностика открива дефект користећи молекуларне методе користећи амплификацију ланчане реакције полимеразе (ПЦР) (вишеструка репликација) ДНК из једне ћелије.

Хромозомални поремећаји

Транслокација, инверзија и делеција доводе до оштећења хромозома, који се може детектовати употребом флуоресцентне хибридизације. Код неких парова, шансе за одрживу трудноћу без ПГД-а су занемарљиве, јер су претходни покушаји довели до појаве ембриона са хромозомском мутацијом и завршили спонтаним побачајима.

Пре-имплантацијски генетски скрининг: релативне индикације

Према студијама, већина раних абортуса у трудноћи настаје због анеуплоидије, што представља кршење броја хромозома. Пошто се здрави ембриони преносе у материцу, вероватноћа побачаја у првом и другом триместру опада.

Тренутно не постоји специфична листа индикација за ПГД.

Генетски скрининг пре имплантације сматра се пожељним у следећим случајевима:

Планирана трудноћа код старије жене.
Оптерећена акушерска и гинеколошка историја са поновљеним побачајима.
Неуспешни вишеструки покушаји ИВФ-а, укључујући ИЦСИ методу.
Фактор мушке неплодности.

Доказана чињеница да се ризик од анеуплоидије повећава са годинама. Хромозоми су мање вероватно да ће се правилно поделити, што ће резултирати додатним или одсутним хромозомом у ембриону. Патолошки број хромозома је више од 20% код мајки у доби од 35 до 39 година, ау доби од 40 и више година 40%.

Учесталост анеуплоидије код деце рођене од 35-39 година - 0,6-1,4%, старије од 39 година - 1,6-10%.

Важно је

Не завршавају све трудноће рођењем одрживог дјетета, понекад се само-прекид догоди прије него жена постане сумњива у свом стању..

Пример учестале анеуплоидије је тризомија 21 хромозома, која доводи до Довн синдрома. Учесталост трисомије 21 у одрживом фетусу процењена је у зависности од старости мајке. Према резултатима, оптимална старост за рађање је од 20-24 године (најнижи ризик је 1/1400). У доби од 40 - 1/100, преко 45 година - 1/25.

Поновни побачај и ПГД дијагноза

Ако жена има 2 или више узастопних прекида трудноће до 20 седмица, ПГД се оправдава прије ИВФ-а. Узрок је често непознат, али се хромозомске абнормалности у абортираним ембрионима дијагностикују у 50-80%.

Обрати пажњу

Истраживања су показала да су парови са вишеструким побачајима изложени већем проценту анеуплоидних ембриона..

ИВФ није успео неколико пута заредом

Три или више неуспјелих покушаја ИВФ-а који укључују ембрионе високог квалитета могу указивати на хромозомске абнормалности. Поред тога, треба се сетити имунолошких и материчних фактора који доприносе смањеној имплантацији..

Фактор мушке неплодности

Мушки хипогонадизам доводи до формирања ембриона са хромозомским абнормалностима. У нормалној сперми присутно је око 3–8% оболелих сперматозоида. Њихов број се значајно повећава код мушкараца са тешком неплодношћу (смањење количине, лоша морфологија и поремећена моторна активност) на 27–74%.

Користећи интрацитоплазматску ињекцију сперме у јајну ћелију, лош квалитет сперме више није препрека за концепцију биолошки нације. Утврђено је да су различити генетски дефекти повезани са мушким фактором неплодности. Чешће, то су анеуплоидија, Клинефелтеров синдром, микроделеција И хромозома, оштећење андрогених рецептора и друге мутације аутосомног гена (цистична фиброза)..

Важно је

Током ИЦСИ процедуре, природна селекција је искључена, тако да се повећава ризик преноса генетских мутација на потомство.

Сек селецтион

ПГД може да одреди пол ембриона, али жеља да се роди дечак или девојчица без доказа (генетске болести повезане са сексом) није етички.

Усклађеност са антигеном хуманог леукоцита (ХЛА)

Међу новим индикацијама ПГД је ХЛА поређење. Овај метод се може користити за искључивање генетске патологије. У ситуацијама када породица већ има дете са рецесивном болешћу, а неопходно је и лечење матичним ћелијама или трансплантацијом коштане сржи (таласемија, леукемија), Могуће је изабрати "одговарајући" ембрион, који ће након рођења постати донатор пробанда (брат или сестра). Први случај је описан на примеру породице са дететом оболелом од Фанцони анемије, а ПГД је извршен да би се изабрао здрав ембрион са истим типом ХЛА као и болесни брат.. Употреба ПГД-а у таквим ситуацијама је спорно због моралних и етичких разлога..

Дијагноза пре имплантације: како се то ради и који су начини

Парове у зони ризика консултује генетичар који процењује ризик од преноса генетске патологије. Провести тестове који потврђују дијагнозу једног од родитеља. У зависности од генетске болести, одабрана је дијагностичка метода којом се могу идентификовати промене у ембриону..

За добијање биоматеријала за ПГД, користи се само ИВФ.. Трећег или петог дана након оплодње, екстрахује се тражени биоматеријал. Генетска анализа пре трансплантације је изведена применом ланчане реакције полимеразе (ПЦР), флуоресцентне хибридизације (ФИСХ), компаративне геномске хибридизације (ЦГХ) и НГС тестирања..

Здрави ембриони се преносе у материцу (по правилу не више од 2), док су остатак витрификовани. Брзо замрзавање вам омогућава да их користите у следећим ИВФ циклусима.

ПЦР

ПЦР се користи за дијагностицирање дефеката појединачних гена, укључујући доминантне и рецесивне поремећаје.. ПЦР (понекад назван ДНА амплификација) је метода у којој се одређена секвенца копира много пута, што омогућава анализу.

За тачну дијагнозу, потребан вам је квалитетан ДНК узорак који је тешко добити из једне ћелије..

Грешке у ПЦР анализи могу довести до преноса ембриона лошег квалитета код 11% у аутосомно доминантну патологију, ау 2% у рецесивној.

Ланчана реакција полимеразе омогућава одређивање дијагнозе, ако постоји:

Дефекти једног гена у аутозомалној болести;
Патологија појединачног гена код мушке неплодности;
Родна идентификација за Кс-повезане болести.

Флуоресцентна хибридизација (ФИСХ)

ФИСХ се користи за одређивање пола за Кс-повезане болести, хромозомске абнормалности и анеуплоидију.

Пробе које представљају мале фрагменте ДНК које одговарају анализираним хромозомима везују се за "свој" хромозом. Свака сонда има своју боју. Процес се визуелизује под флуоресцентним микроскопом. Број хромозома сваке боје се броји и закључци се извлаче..

Флуоресцентна ин ситу хибридизација је оправдана ако је потребно извршити:

Анеуплоидни скрининг код жена старијих од 38-39 година;
Бројање броја хромозома у мушкој неплодности;
Идентификација полова код болести повезаних са Кс;
Дијагноза родитељских транслокација које су довеле до поновљених вишеструких побачаја.

Компаративна геномска хибридизација (ЦГХ, СХГ)

Људска ћелија садржи 23 пара хромозома; међутим, ФИСХ анализа омогућава тачну процену само 7-9 хромозома у свакој добијеној ћелији. Сходно томе, многи абнормални ембриони остају неоткривени и могу се користити у трансферу.

Када се врши компаративна геномска хибридизација, тест ДНК се третира са флуоресцентном бојом (зелена), а црвена се користи за узорак. Затим се две ћелије хибридизују, и упоређује се однос између две боје. Ако анализа хромозома показује вишак црвеног, ембрионско језгро садржи додатни хромозом. Ако постоји вишак зелене боје, онда један од хромозома недостаје у језгру ембрија.. СХС омогућава не само да процени свих 23 хромозома, већ даје и детаљнију слику дужине која може детектовати неравнотежу сегмената хромозома..

Овај метод тренутно траје 72 сата. С обзиром на ограничен животни век ембриона у медијуму културе, неопходно је витрификација ембриона. Чак и са високим преживљавањем, криопрезервација може довести до 30% губитка виталних ембриона..

Обрати пажњу

У великим репродуктивним клиникама, они већ раде на убрзаним протоколима СХГ, гдје резултат постаје познат након 24 сата, што омогућава да не пропустите оптимално вријеме за пријенос.

НГС тестинг

Метода укључује одређивање секвенце нуклеотида (основних структура насљедног материјала) у РНК и ДНК.

Предности укључују:

способност процене корисности / дефеката свих хромозома
минимизирање грешака због аутоматизације процеса;
симултано декодирање вишеструких секвенци;
поновљена анализа локуса генетског кода;
висока осетљивост и прецизност;
минимизирање погрешног закључка (0,001%);
атрауматски за ембрион;
повећати шансе за успешан ИВФ.

Апсолутне индикације за НГС: превоз хромозомских абнормалности код родитеља или рода, генетске болести повезане са полом.

Студија пре имплантације НГС обухвата следеће кораке:

биопсија ембриона у фази бластоциста, чешће биопсија трофектодерма;
изолација молекула нуклеинске киселине;
стварање основа за накнадно генетско тестирање,
амплификација за добијање ампликона ПЦР методом, који се узимају као узорак;
компјутеризована визуализација примарног ДНК / РНК модела као резултат вишеструке, непаралелне анализе фрагмената.

Специјалиста процењује компјутерску графику која показује патологију у облику дипова или врхова.

На основу НГС тестирања, ембриони са ниском виталношћу или са клинички израженим мутацијама се одбацују, а остатак након одмрзавања користи се у ИВФ протоколима.

Нису све репродуктивне клинике спровеле ову анализу..

Важно је

Дијагноза пре имплантације није укључена у листу услуга за обавезно здравствено осигурање и плаћа се од стране пацијента.

Шта се истражује са ПГД

Већина клиника изводи биопсију ембриона у фази цијепања, али једна од 3 методе може се користити за ПГД.

Биопсија поларног тела

Метода је погодна за детекцију генетске патологије код жена, јер се процењује број хромозома у јајној ћелији. Биопсија поларног тела не дозвољава да се добију информације о хромозомској структури будућег ембриона, јер ће добити другу половину генетског материјала од оца. Овај метод се ретко користи..

Биопсија ембриона са хетцхингом

Најчешћа метода ПГД-а је проучавање једног бластомера добијеног из развијеног ембрија трећег дана. Узимање бластомера је технички захтјевна процедура, а проводи се помоћу посебног микроскопа и микроманипулатора. Циљ је да се уклони жељена ћелија са минималном траумом ембриона.

Трећег дана развоја, ембрион се састоји од 6-10 ћелија, пре манипулације се чува у посебном окружењу 20 минута како би се смањило лепљење бластомера. Затим се ембрион фиксира и унутар зоне пеллуцида се ствара рупа која отвара приступ бластомерима. Ова процедура се назива "излегавање" и може се извести употребом киселог раствора, ласера или механички. У отвор се убацује пипета, која се фокусира на одабрани бластомер са видљивим језгром. Аспирацијом се бластомери екстрахују и обрађују за ФИСХ, или за ПЦР (ПЦР дијагноза), у зависности од генетске патологије. Ембрио је уроњен у одговарајући медијум за културу..

Недостаци методе укључују чињеницу да ембрион може бити мозаик, а за генетску анализу постоји вероватноћа да се уклони "здрав" бластомер.

Бластоцист биопсија

Формирање бластоцисте почиње петог дана и одређује се акумулацијом унутрашње и спољашње ћелијске масе. У овој фази, ембрион се састоји од око 100 ћелија. Кроз рупу, ћелије се узимају из трофектодерма помоћу танког пипета за биопсију. Унутрашња ћелијска маса није повређена. Генетска анализа се изводи употребом ФИСХ или ПЦР.

Ограничење дијагностичке процедуре - мозаик ембрија и потребно вријеме за студију - 24-48 сати, што значајно смањује виталност и ремети имплантацију.

Једини излаз је замрзавање биоматеријала, након чега квалитет ембрија мало пати.

ПГД се у већини случајева завршава у року од 24 сата након извршене биопсије, што вам омогућава да извршите трансфер 4. или 5. дана.

Обрати пажњу

Већина клиника анализира 24 хромозома (22 аутосома и 2 полна хромозома) користећи компаративну геномску хибридизацију на ембриону у доби од 5 дана..

За и против генетске анализе у тродневним и петодневним ембрионима

Три дана:

већи ризик од повреда (око 15%, важну улогу игра квалификација ембриолога);
способност да се изврши анализа на само 9 хромозома, укључујући само најчешће наследне болести;
вероватноћа биохемијског и пропуштеног побачаја услед патологије у неистраженим хромозомима;
мозаицизам.

Пет дана:

одрживост ембриона се смањује пошто постоје изван мајчиног тела, постоји потреба да се сачека да се изврши биопсија (могуће је подвргнути рани бластоциста витрификацији или трансферу);
заустављање развоја "добрих" ембриона који нису повезани са генетским факторима;
могућност спровођења свеобухватне хромозомске анализе;
низак ризик од оштећења ембриона (око 5%).

Важно је

Ембриони лошег квалитета се одбацују ако се њихов пренос деси, или се трудноћа није појавила или завршила у развоју или само-прекиду у раним фазама..

Који је најбољи начин за ПГД

Стручњаци сматрају да је компаративна геномска хибридизација боља од

ФИСХ-дијагностика, јер су могућности методе шире, а ризик од повреде ембриона је мањи. Са особитостима кариотипа родитеља (нпр. Транслокација) постоји могућност спајања интеркромосомског ефекта - ризик од неправилне дивергенције било ког хромозома, а не само оних оштећених и дијагностикованих током кариотипирања мајке или оца.

Недостаци укључују потребу за криопрезервацијом и високим трошковима.

ФИСХ студија је пожељнија од ПЦР, пошто реакција полимеразе носи ризик погрешне дијагнозе због биолошке контаминације..

Данас је најефикаснија метода - НГС - секвенцирање нове генерације.

Мисхина Вицториа, уролог, лекар